《豆制品中嘌呤的测定 超高效液相色谱 - 串联质谱法》（征求意见稿）
一、引言
豆制品作为我国传统饮食中重要的组成部分，以其丰富的营养价值和多样的口感深受大众喜爱。豆制品富含蛋白质、维生素、矿物质以及多种生物活性成分，对人体健康有着诸多益处，如降低胆固醇、预防心血管疾病等。然而，豆制品中也含有一定量的嘌呤。嘌呤在人体内代谢后会产生尿酸，当体内尿酸生成过多或排泄减少时，就可能导致高尿酸血症，进而引发痛风等疾病。随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，高尿酸血症和痛风的发病率呈逐年上升趋势，这使得对食品中嘌呤含量的准确测定变得尤为重要。
超高效液相色谱 - 串联质谱法（UPLC - MS/MS）作为一种先进的分离分析技术，具有高灵敏度、高选择性、高分辨率和快速分析等优点。它能够同时对多种嘌呤化合物进行定性和定量分析，为准确测定豆制品中嘌呤含量提供了可靠的技术手段。本征求意见稿旨在规范使用超高效液相色谱 - 串联质谱法测定豆制品中嘌呤的具体操作流程、技术要求和质量控制等内容，以确保测定结果的准确性和可靠性。
二、范围
本征求意见稿适用于各类豆制品中嘌呤的测定，包括但不限于豆腐、豆浆、豆干、腐竹等。所测定的嘌呤化合物主要包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤等。
三、方法原理
超高效液相色谱 - 串联质谱法是基于不同物质在超高效液相色谱柱上的保留时间差异以及在质谱仪中的特征离子碎片信息进行定性和定量分析。首先，将豆制品样品经过适当的提取和净化处理，使嘌呤化合物从样品基质中分离出来。然后，将提取液注入超高效液相色谱系统，在特定的流动相条件下，不同嘌呤化合物在色谱柱上实现分离。分离后的化合物依次进入质谱仪，在质谱仪的电离源作用下发生电离，产生特征离子碎片。通过检测这些特征离子碎片的质量和相对丰度，结合预先设定的质谱参数，对嘌呤化合物进行定性和定量分析。
四、试剂和材料
（一）试剂
1、甲醇：色谱纯，用于流动相配制和样品提取。
2、乙腈：色谱纯，作为流动相的有机相成分。
3、甲酸：优级纯，用于调节流动相的pH值。
4、超纯水：电阻率不小于18.2 MΩ·cm，用于流动相配制和样品处理。
5、标准品：腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤标准品，纯度不低于98%。
（二）材料
1、超高效液相色谱柱：C18反相色谱柱，规格根据实际分析需求选择。
2、质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）的三重四极杆质谱仪。
3、微孔滤膜：0.22 μm，有机相或水相适用，用于样品过滤。
4、离心管：不同规格，用于样品处理和保存。
五、仪器设备
（一）超高效液相色谱仪
应具备二元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器（DAD）等功能模块。泵的流量精度应不低于±1%，自动进样器的进样精度应不低于±1%。柱温箱的温度控制精度应不低于±0.5℃。
（二）质谱仪
三重四极杆质谱仪应具备电喷雾离子源（ESI），能够进行正离子模式和负离子模式扫描。质谱仪的质量分辨率应不低于1个质量单位，质量准确度应不超过±0.1 Da。扫描速度应满足分析要求，确保能够准确检测到目标化合物的特征离子碎片。
（三）其他设备
包括天平（感量0.1 mg和0.01 g）、涡旋混合器、离心机（转速不低于10000 r/min）、超声波清洗器等。
六、样品采集与处理
（一）样品采集
应从市场上或生产现场采集具有代表性的豆制品样品。采集的样品应密封保存，避免受到污染和变质。对于固态豆制品，应将其切成小块；对于液态豆制品，应充分摇匀后取样。
（二）样品处理
1、提取：准确称取一定量的豆制品样品（一般为2 - 5 g）于离心管中，加入适量的提取溶剂（如甲醇 - 水混合溶液），涡旋混合均匀后，置于超声波清洗器中超声提取一定时间（如15 - 30 min）。然后，将离心管放入离心机中，以一定转速离心一定时间（如10000 r/min离心10 min），取上清液。
2、净化：可采用固相萃取（SPE）等方法对提取液进行净化。选择合适的固相萃取柱（如C18固相萃取柱），先用适量的甲醇和水活化固相萃取柱，然后将提取液过柱，再用适量的水洗涤固相萃取柱以去除杂质，最后用适量的有机溶剂（如甲醇）洗脱目标化合物，收集洗脱液。
3、过滤：将净化后的洗脱液用0.22 μm的微孔滤膜过滤，滤液收集于进样瓶中，待上机分析。
七、标准溶液的配制
（一）单标储备液的配制
准确称取一定量的腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤标准品，分别置于容量瓶中，用适量的溶剂（如甲醇 - 水混合溶液）溶解并定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL的单标储备液。将单标储备液储存于 - 20℃冰箱中，保存期不超过3个月。
（二）混合标准工作液的配制
吸取适量的单标储备液，用溶剂稀释配制成一系列不同浓度的混合标准工作液。混合标准工作液的浓度范围应根据实际样品中嘌呤的含量进行确定，一般应涵盖样品中可能出现的浓度范围。混合标准工作液应现用现配。
八、超高效液相色谱 - 串联质谱条件
（一）超高效液相色谱条件
1、流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈。采用梯度洗脱程序，初始比例为A相95%，B相5%；在一定时间内（如0 - 5 min）保持该比例，然后逐渐增加B相的比例，在一定时间（如5 - 10 min）内B相比例增加至20%，并保持一段时间（如10 - 15 min），最后在短时间内（如15 - 15.1 min）将B相比例降至5%，并保持至分析结束（如15.1 - 20 min）。
2、流速：0.3 - 0.5 mL/min。
3、柱温：30 - 40℃。
4、进样量：1 - 5 μL。
（二）质谱条件
1、离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子模式。
2、喷雾电压：根据质谱仪的具体型号和实际分析情况进行优化设置。
3、离子传输管温度：一般为300 - 350℃。
4、碰撞气压力：根据目标化合物的性质和分析要求进行优化设置。
5、定性离子对和定量离子对：通过优化质谱参数，确定每种嘌呤化合物的定性离子对和定量离子对。例如，腺嘌呤的定性离子对可能为m/z 136→119，定量离子对为m/z 136→92；鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤也有各自特定的定性离子对和定量离子对。
6、扫描方式：多反应监测（MRM）模式。
九、定性分析
在相同的色谱 - 质谱条件下，将样品溶液与混合标准工作液分别进样分析。根据样品中目标化合物的保留时间与混合标准工作液中相应化合物的保留时间是否一致，以及样品中目标化合物的特征离子碎片与混合标准工作液中相应化合物的特征离子碎片是否匹配，对样品中的嘌呤化合物进行定性。保留时间允许有一定的偏差，一般不超过±0.2 min；特征离子碎片的相对丰度比也应符合一定的要求，以排除假阳性结果。
十、定量分析
采用外标法进行定量分析。以混合标准工作液的浓度为横坐标，以目标化合物的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线的线性相关系数应不低于0.995。根据样品溶液中目标化合物的峰面积，从标准曲线上查出相应的浓度，再结合样品的稀释倍数和称样量，计算出样品中嘌呤化合物的含量。
十一、方法验证
（一）线性范围
通过配制一系列不同浓度的混合标准工作液，按照上述分析方法进行测定，绘制标准曲线。确定每种嘌呤化合物的线性范围，应满足实际样品分析的要求。
（二）检出限和定量限
以信噪比（S/N）为3时对应的浓度作为检出限，以信噪比（S/N）为10时对应的浓度作为定量限。通过逐步稀释混合标准工作液进行测定，确定每种嘌呤化合物的检出限和定量限。
（三）准确度
采用加标回收率试验来评价方法的准确度。在已知含量的豆制品样品中加入一定量的标准品，按照样品处理和分析方法进行测定，计算加标回收率。加标回收率应在80% - 120%之间。
（四）精密度
包括重复性和再现性。重复性是指在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，在短时间内对同一被测对象相互独立进行的测试条件下的精密度。通过重复测定同一豆制品样品多次（如6次），计算相对标准偏差（RSD）来评价重复性，RSD应不超过10%。再现性是指在不同实验室，由不同操作者使用不同设备，按相同的测试方法，对同一被测对象相互独立进行的测试条件下的精密度。通过多个实验室对同一豆制品样品进行测定，计算再现性相对标准偏差，应符合相关要求。
十二、注意事项
（一）在样品处理过程中，应注意避免样品受到污染和损失。提取溶剂的选择和用量应根据样品的性质和分析要求进行优化。
（二）超高效液相色谱 - 串联质谱仪的使用和维护应严格按照仪器说明书进行操作。定期对仪器进行校准和维护，确保仪器的性能稳定。
（三）标准溶液的配制应准确无误，避免因标准溶液浓度不准确而导致测定结果偏差。
（四）在分析过程中，应注意观察色谱图和质谱图，及时发现异常情况并进行处理。
关键词：豆制品、嘌呤测定、超高效液相色谱 - 串联质谱法、方法验证
简介：本征求意见稿针对豆制品中嘌呤测定，详细阐述了超高效液相色谱 - 串联质谱法的应用。涵盖范围、方法原理、试剂材料、仪器设备、样品处理、标准溶液配制、色谱 - 质谱条件、定性与定量分析、方法验证及注意事项等内容，旨在规范测定流程，确保结果准确可靠。
